产品简介

土壤羟胺还原酶(HR)测试盒微量法公司正在出售的产品：兽类嗜衣原体PCR检测试剂盒Chlamydophila pecorumPCR肺炎嗜衣原体PCR检测试剂盒Chlamydophila pneumoniae PCR鹦鹉热嗜衣原体PCR检测试剂盒Chlamydophila psittaciPCR嗜衣原体通用PCR检测试剂盒Chlamydophila spp. PCR

土壤羟胺还原酶(HR)测试盒微量法

本公司所有产品仅供科学实验，不做其他科学实验外的使用！
商品属性：

测定意义：

土壤羟胺还原酶能将土壤中氮代谢过程中形成的中间产物羟胺还原为氨，土壤中的还原态化合物可作为氢的供体，其强弱影响到土壤氮代谢过程中氮素的氨挥发损失，间接影响氮肥的利用效率。

测定原理

硫酸铁铵中的Fe3+可将羟胺氧化为氮气，自身被还原为Fe2+，Fe2+在弱酸条件下与邻菲罗琳形成橙红色配合物，在510nm处有吸收峰，羟胺还原酶作用于羟胺，使配合物形成量减少，510nm处吸光值的减少可反映羟胺还原酶的活性。

自备实验用品及仪器

天平、常温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、震荡仪、氮吹仪。

试剂的组成和配制:

提取液一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 14uL×1 支，4℃保存；

组织样本的前处

①总 GAPDH 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 GAPDH 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 GAPDH 酶活性，取沉淀加 1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取清测定叶绿体中 GAPDH 酶活性。建议测定总 GAPDH 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。细菌或培养细胞的前处理先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在试剂三中加入 500μL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 5μL 样本、5μL 试剂三和 190μL 工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=2.572×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2572×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=2572×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=5.144×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.005 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

生化试剂盒的使用注意事项：

选择合适的试剂盒：根据实验目的和检测对象选择合适的试剂盒，确保实验的准确性和可靠性。

严格遵循说明书：按照试剂盒的说明书进行操作，避免误用或浪费。

注意保存条件：按照试剂盒的保存条件进行妥善保存，避免阳光直射、高温或潮湿等不利因素。

控制实验条件：在实验过程中严格控制实验条件，如温度、时间、pH值等，以确保实验结果的稳定性。

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