产品简介

线粒体活性氧产生速率(ROS)测试盒荧光法试验需自备的仪器和用品：多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

商品属性：

测定意义：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，研究表明，机体95％以上的活性氧（ROS）都来自于线粒体，其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。

正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态，细胞内活性氧（ROS）水平维持在较低的生理范围；在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破，细胞内活性氧水平过多，就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，同时，活性氧还可攻击线粒体DNA产生氧化损伤，导致线粒体ATP合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。

因此，通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。

测定原理：

荧光探针-还原型二氯荧光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可扩散通过线粒体膜，在线粒体内被酯酶水解，形成无荧光的DCFH，DCFH迅速与ROS反应生成荧光物—氧化型二氯荧光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根据上述原理设计了利用荧光法直接定量检测线粒体ROS产生速率的方法。将荧光强度随时间变化的数据点拟合，线性回归直线斜率与ROS产生的速率呈正比。

需自备的仪器和用品：

多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液一：液体25mL×1瓶，4℃保存。

提取液二：液体25mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存。

试剂二：液体25mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体14μL×1支，4℃保存。

组织样本的前处理：

①总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇 7s，总时间1min），然后 4℃，8000g离心10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例（建议称取约0.1g样本，加入1mL提取液一），冰浴匀浆后于4℃，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃，8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇7s，总时间 1min），然后4℃，8000g离心10min，取上清测定叶绿体中GAPDH酶活性。

建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的GAPDH，则按照步骤②提取粗酶液。细菌或培养细胞的前处理先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在试剂三中加入500μL蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（3）在1mL石英比色皿中加入30μL样本、20μL试剂三和950μL工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录 340nm处20s时的吸光值A1和5min20s后的吸光值。

A2，计算ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1072×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=1072×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T=2.144×ΔAV 反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

生化检测试剂盒实验操作说明：

一、抗氧化系列生化检测试剂盒

包括氧化酶（XO）活性分析、超氧阴离子清除能力分析、葡萄糖氧化酶活性（GOD）检测、总抗氧化能力（TAC）检测、植物原花青素(OPC)含量检测、植物类黄酮含量检测、植物总酚（TP）含量检测试剂盒。

氧化酶（XO）活性分析试剂盒为例，提供了一种简单易用的比色分析法，用于测定各种样品中的XO活性，特点是测定血清，血浆，组织/细胞裂解物和其他生物体液中的氧化酶活性，以及广泛的检测范围：15.6-500mU/mL。

二、氧化系列生化检测试剂盒

包括过氧化氢酶 (CAT) 活性分析、过氧化氢（H2O2）检测、脂质过氧化(丙二醛) 分析、蛋白质羰基含量检测、超氧阴离子含量检测等试剂盒。

蛋白质羰基含量检测试剂盒（比色法）为例，提供了一种简单易用的比色法，用于分析不同生物样品（细胞/组织裂解液，生物液体）中蛋白质羰基含量。在370 nm处有特征吸收峰。

特点是：

1.测定组织样本、细胞、细菌、血清等中的蛋白质羰基含量。

2.样本处理、实验步骤以及结果计算更加详尽准确精炼。

3.保质期长。

三、抗逆系列生化检测试剂盒

包括超氧化物歧化酶 (SOD) 活力检测、羟自由基清除能力分析、多酚氧化酶（PPO）活性检测、过氧化物酶(POD)活性检测等试剂盒。

超氧化物歧化酶 (SOD) 活力检测试剂盒为例，提供一种简单易用的比色测定法，用于定量测定血清，血浆，组织/细胞裂解液和其它生物体液中的SOD酶活性。

特点是：

1.测定血清，血浆，组织/细胞裂解物和其他生物体液中的SOD酶活性。

2.通过WST-8法测定SOD活性，最大抑制率可接近100％，不受一些常见干扰因素的干扰。

3.广泛的检测范围：3.13- 200U/mL。

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