荧光探针PCR试剂盒因特异性及简便的操作流程而广受欢迎

 

　　1、准备工作

 

　　在开始任何实验之前，仔细阅读并理解所用荧光探针PCR试剂盒的说明书。不同品牌和类型的试剂盒可能有要求或优化条件。确保所有需要的试剂和设备都已准备好，包括但不限于模板DNA/RNA、引物、探针、酶混合物、缓冲液以及所需的耗材如PCR管或板。此外，检查所有仪器是否正常工作，比如热循环仪应经过校准以保证温度控制的准确性。

 

　　2、样本处理与质量控制

 

　　高质量的样本是获得可靠结果的基础。对于RNA样品，建议先进行DNase处理以去除潜在的基因组DNA污染；而对于DNA样品，则需评估其纯度和浓度，通常通过紫外分光光度计测量A260/A280比值来确定。理想的比值应在1.8至2.0之间。同时，对样本进行适当的稀释，确保PCR反应体系中的核酸量处于推荐范围内。

 

　　3、试剂配制与加样

 

　　按照说明书指示，准确配制PCR反应混合物。这通常涉及将酶、缓冲液、dNTPs、引物和探针等成分按比例混合。注意避免反复冻融酶制剂，并尽量减少操作时间以防酶活性丧失。使用无菌技术小心地向每个PCR管或孔中加入适量的反应混合物和样本，确保无气泡产生且各孔间无交叉污染。使用带滤芯的移液器吸头可有效防止这种污染。

 

　　4、运行PCR与数据分析

 

　　设置好热循环仪的程序参数，包括变性、退火和延伸温度及时长，具体数值依据所用引物和目标序列特性调整。启动PCR后，实时监控荧光信号变化，记录Ct值（阈值循环数）。Ct值反映了目标序列在反应中被检测到的时间点，较低的Ct值表示较高的起始拷贝数。完成PCR后，利用配套软件分析数据，绘制标准曲线计算未知样本中的目标序列浓度。