6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH） 样本的前处理

6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH） 样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆 600g，4℃离心5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 NOX（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于NOX活性测定。

血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至600nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）试剂四于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min。

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、200μL试剂四和40μL试剂五，混匀，记录600nm处20s时吸光值A1和1min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

NOX 活力单位的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）NOX活力的计算:

单位的定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A600变化0.01定义为一个酶活力单位。

NOX（U/mL）＝ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=2500×ΔA

2、组织、细菌或细胞中NOX活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A600变